我们都知道，与晚发的非家族性阿尔茨海默病（AD）关联最强的遗传因素就是APOE4[1,2]，有大约14%的人携带这一遗传变异，而从另一个角度来看，在整个AD患者群体中，约50%都是APOE4携带者，就是如此重要的一个遗传变异，但我们对它如何影响AD的发生发展仍然还不清楚[3]。
来自美国麻省理工学院的蔡立慧教授的团队一直致力于研究APOE4对大脑中各种类型细胞影响。
2018年时，他们发现，APOE4会导致神经元产生大量β淀粉样多肽42，导致神经元过度活跃，除此之外，小胶质细胞和星形胶质细胞也会受到影响，导致胆固醇积累和炎症，无法清除沉积的β淀粉样蛋白[4]。2021年，他们将研究结果继续推进，证明了APOE4会使星形胶质细胞的脂质代谢能力严重受损[5]。
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时间来到2022年，这一次，轮到了小胶质细胞。
蔡教授的团队发现，APOE4也破坏了小胶质细胞的脂质代谢能力，这导致脂质分子，尤其是胆固醇的积累，它们会与神经元细胞膜中特定类型的钾离子通道结合，从而抑制神经元放电，神经元兴奋性下降，这是会在AD后期出现的一种现象。另外，脂质的积累还会导致炎症，神经炎症也是已知的促进AD进展的因素之一。
这个发现未来或许还能帮助研究人员构建模拟AD后期的研究模型。研究结果发表在了《细胞·干细胞》杂志上[6]。
研究依托于研究团队此前利用诱导性多能干细胞（iPSCs）的CRISPR-Cas9基因组编辑，可以衍生出除了APOE等位基因不同，其他基因相同的等基因细胞系，包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞[4]。
大脑中的小胶质细胞高表达嘌呤能受体P2RY12，嘌呤能信号是小胶质细胞趋化、吞噬和产生促炎因子的重要调节信号，P2RY12能够感知细胞外的能量分子（ADP和ATP）。很多可溶性神经元因子也参与小胶质细胞对神经元活动的监测，例如CX3CL1-CX3CR1信号轴。
另外，小胶质细胞还表达大量神经递质受体，介导神经元-小胶质细胞通讯。研究团队用iPSCs衍生出的小胶质细胞样细胞（iMGLs）也同样表达这些重要受体，与小胶质细胞高度一致。
iMGLs表达典型的小胶质细胞受体
为了确定APOE4对神经元-小胶质细胞通讯功能的影响，研究人员同时构建了APOE3和APOE4 iMGLs，APOE3与APOE4仅差一个氨基酸，但它对AD的影响就是中性的了。
通过使用不同类型的选择性抑制剂进行重复实验，研究人员发现，嘌呤能信号在APOE4 iMGLs中受损，由于嘌呤能受体P2RY12的减少与小胶质细胞激活状态有关，研究人员推断，APOE4 iMGLs的监测状态发生了改变，削弱了对神经元活动的监测。
转录谱分析进一步坐实了他们的推断。APOE4 iMGLs转录反应更强，在HIF-1和JAK-STAT信号，以及细胞因子-细胞因子受体相互作用方面显著富集，提示其具有强烈的促炎反应。细胞内钙离子信号通路的诱导减少，钙瞬态下降。P2RY12表达水平显著降低，而与小胶质细胞“高度警觉”状态有关的P2RY6则没有显著增加。此外，还有很多稳态基因表达也显著减少，包括CX3CR1和CSF1R。
这些结果提供了分子层面的佐证，接下来，把目光挪到细胞层面。
奇点网，赞46我们知道，促炎刺激可以诱导小胶质细胞的代谢转换，从氧化磷酸化（OXPHOS）转换为糖酵解[7]，研究人员也确实发现，APOE4 iMGLs中葡萄糖转运蛋白GLUT3的水平有微小但显著的增加，另外，刚刚提到过的显著富集的HIF-1信号也正好是糖酵解的主要转录调控因子[8]。
能量消耗和脂肪酸氧化损伤与活化小胶质细胞内脂质积累有关，在氧化磷酸化相关基因表达减少的同时，研究人员确实也观察到了APOE4 iMGLs中脂质分解代谢过程相关的差异表达基因和膜脂肪酸转运蛋白CD36减少。
氧化磷酸化相关基因表达有显著的下降
对脂滴进行染色后发现，APOE4 iMGLs中脂滴含量显著增加，G蛋白激活下游钙信号通路可以通过激活蛋白激酶A和C（PKA和PKC）促进脂质分解，与这一重要机制相一致的，研究人员观察到APOE4 iMGLs中编码PKA和PKC催化和调控结构域的基因表达减少。
APOE作为大脑中的主要胆固醇转运蛋白，介导神经元和胶质细胞之间的胆固醇及其他脂质的传递。APOE4 iMGLs培养物上清液中富含APOE和胆固醇，之前的研究认为，胆固醇的增加与APOE4胶质细胞的脂质转运减少有关[9]，但研究人员推断，细胞外的脂质积累也可能是相对更严重的脂质细胞内流缺陷的“产物”。
为了验证这个推断，他们将APOE3和APOE4 iMGLs同时和人血浆中分离出的低密度脂蛋白胆固醇（LDL）共培养，与APOE3相比，APOE4 iMGLs对LDL的细胞摄取大大减少。
与APOE3相比，APOE4 iMGLs的脂质摄取大大减少
对于神经元来说，外源性胆固醇的加入使得静息膜电位发生了超极化，电流-电压曲线也发生了变化，内向整流钾离子（Kir）电流增强，而Kir电流的增强正是静息膜电位超极化的原因，并且会降低神经元兴奋性。
在Kir通道中，由KCNJ9基因编码的Kir3.3通道（GIRK3）大量表达，和其他Kir通道一样可以调节神经元兴奋性，发挥功能时降低神经元活性，丧失功能时则增加神经元活性，而且GIRK通道刚好是脂质门控通道，在神经元中，胆固醇会增强它的活性，从而降低神经元兴奋性。GIRK通道位于神经元细胞膜上富含胆固醇的微结构域，也就是脂筏，而在APOE4 iMGLs中，脂筏增加。
研究人员查阅了已经公开发表的AD患者的snRNA测序数据[10]，发现与没有AD的对照组相比，AD患者的兴奋性神经元中GIRK2和GIRK3的水平显著增加。
也就是说，APOE4使得小胶质细胞的脂质代谢能力受损，这导致了脂质分子“流落在外”，积累的脂质分子使得神经元细胞膜中的Kir电流增强，使得静息膜电位超极化，降低了神经元兴奋性。
研究人员尝试使用能够抑制脂滴形成的三氮菌素C处理了APOE4小胶质细胞，成功减少了脂质积累，神经元活动得以恢复正常。不过三氮菌素C具有细胞毒性，不适合真的用于治疗AD，但这个研究为我们指明了一个新的方向，即恢复脂质稳态，以对抗APOE4对神经胶质细胞和神经元的影响。
研究的第一作者Matheus B. Victor博士表示，恢复大脑中不同类型细胞的脂质稳态至关重要，但这不是一件容易的事，此前他们发现胆碱可能有这种潜力，未来，还需要进行更多的探索。
参考文献：
[1] Liu C C, Kanekiyo T, Xu H, et al. Apolipoprotein E and Alzheimer disease: risk, mechanisms and therapy[J]. Nature Reviews Neurology, 2013, 9(2): 106-118.
[2] Yamazaki Y, Zhao N, Caulfield T R, et al. Apolipoprotein E and Alzheimer disease: pathobiology and targeting strategies[J]. Nature Reviews Neurology, 2019, 15(9): 501-518.
[3] https://news.mit.edu/2022/microglia-apoe4-alzheimers-0804
[4] Lin Y T, Seo J, Gao F, et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer’s disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types[J]. Neuron, 2018, 98(6): 1141-1154. e7.
[5] Sienski G, Narayan P, Bonner J M, et al. APOE4 disrupts intracellular lipid homeostasis in human iPSC-derived glia[J]. Science translational medicine, 2021, 13(583): eaaz4564.
[6] Victor M B, Leary N, Luna X, et al. Lipid accumulation induced by APOE4 impairs microglial surveillance of neuronal-network activity[J]. Cell Stem Cell, 2022, 29(8): 1197-1212. e8.
[7] Lauro C, Limatola C. Metabolic reprograming of microglia in the regulation of the innate inflammatory response[J]. Frontiers in Immunology, 2020, 11: 493.
[8] Cheng S C, Quintin J, Cramer R A, et al. mTOR-and HIF-1α–mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity[J]. Science, 2014, 345(6204): 1250684.
[9] Liang S A, Qian L, Pipalia N H, et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia[J]. Preprint at bioRxiv, 2019.
[10] Mathys H, Davila-Velderrain J, Peng Z, et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer’s disease[J]. Nature, 2019, 570(7761): 332-337.
